前不久，笔者介绍过生物技术药物5大类别的特点及其市场和代表药物情况。在细述上述内容的基础上，本稿件将从技术角度来聊一聊，生物技术药物的药学研究都有哪些内容。PS：大多数生物技术药的化学本质是蛋白质，其药学研究有不同于化学药物的特殊性，下面将以蛋白质药物为例来进行说明。

       01  稳定性~影响蛋白质类药物的重要属性之一！

       相对而言，蛋白质类药物的稳定性不如化学药物，其不稳定性可简单分为两种：化学不稳定和物理不稳定。

       化学不稳定

       主要指蛋白质分子通过共价键的形成和断裂形成新的化学实体，包括水解、氧化、外消旋、β消旋和二硫键的交换。一般肽键在生理条件下相当稳定，但可被酸、碱或蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量减少。蛋白质中一些氨基酸可以发生自氧化，在氧化剂存在下，蛋白质中的某些氨基酸侧链很容易被氧化，使蛋白质失活。含有芳香侧链的氨基酸如甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸的蛋白质易发生氧化反应（影响氧化的因素有温度、pH、缓冲介质、催化剂的种类和氧的强度等）。蛋白质在碱水解中常伴有某些氨基酸的消旋化作用，使氨基酸成为非代谢形式，从而改变蛋白质的生物活性（影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH、离子强度和金属离子螯合作用）。二硫键对稳定蛋白质的构象起重要作用，加热可引起二硫键的断裂或交换，导致蛋白质的生物活性快速丧失。

       物理不稳定

       指蛋白质分子的高级结构的物理转变，无共价键改变，包括变性、表面吸附、聚集和沉淀。蛋白质中非共价键的破坏可导致蛋白质变性。在某些物理、化学的条件下，蛋白质分子的高级结构受到破坏（但一级结构未被破坏），结果引起蛋白质生物活性的损失和理化性能的改变，这就是蛋白质的变性。影响蛋白质变性的因素有：温度、pH、盐类、有机溶剂、表面活性剂、机械应力、超声波、光照等。

       表面吸附可导致蛋白质构象的变化，使蛋白质分子变性，活性丧失。同时由于蛋白质多肽类药物有效剂量小，吸附作用使制剂中药物含量显著降低，疗效降低。使用表面活性剂、加入载体蛋白如血清白蛋白可减少其表面吸附。蛋白质溶液是一种稳定亲水胶体，但在外界因素（pH、溶剂、离子强度、溶剂介电常数）的影响下发生自缔合形成二聚体、低聚物等。在外界因素影响下，蛋白质分子结构发生伸展，疏水区暴露于水性环境，形成热力学不稳定体系，驱使暴露的疏水区分子间相互聚集形成聚集体。蛋白质沉淀通常与变性同时发生。蛋白质溶液中加入大量的中性盐、重金属、有机溶剂或者加热均可导致蛋白质的沉淀。

       02  蛋白质类药物相关给药系统

       现如今，小分子药物已形成多种给药方式，但对于大分子生物制剂，通常仍以注射给药为主，但近年来口服给药等小分子药物常用剂型已逐渐成为开发大分子药物的亮点。

       蛋白质类药物给药途径

       注射给药

       蛋白质、多肽类药物由于口服吸收的限制，临床多采用注射途径给药，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、腹腔注射。但蛋白质、多肽类药物一般体内血浆半衰期较短，清除率高，须频繁注射给药。

       延长蛋白多肽类药物体内半衰期最简单的方法是静脉注射给药改为肌内注射或皮下注射。采取此法时应注意随之引起的蛋白质降解和体内的变化。另一种方法是采取新的给药系统延缓药物的释放，如输入泵、生物降解性微球、微乳、复乳、脂质体、纳米粒和聚合物结合物。此外，对蛋白质分子进行化学修饰以抑制其清除，目前最常用的是聚乙二醇修饰。

       口服给药

       蛋白质类药物的口服给药存在以下限制，1）被胃酸催化降解；2）被胃肠道内的酶水解；3）对胃肠道黏膜的透过性差；4）存在肝的首过效应。采用吸收促进和新型微粒给药系统（如微乳、纳米粒、脂质体）可提高其吸收。

       其他给药途径

       包括鼻腔给药系统（鼻粘膜）、肺部给药系统（肺粘膜）、直肠给药系统、口腔黏膜和经皮给药系统。这些给药途径的优点是均不同程度地避免了药物的肝 脏首关效应，给药部位蛋白水解酶的活性较低，药物在给药部位稳定性增强，其中鼻粘膜和肺粘膜给药吸收较快。共同的缺点是生物利用度较低。

       如何促进蛋白质类药物的吸收

       提高吸收屏障的通透性

       加入化学类吸收促进剂，如脂肪酸、磷脂、胆盐、苯基甘氨酸酰胺衍生物、酯和醚型的（非）离子表面活性剂、皂角苷类、水杨酸酯衍生物、梭链孢酸、甘草酸衍生物或二甲基-β-环糊精；或通过离子导入技术和脂质体载体技术提高通透性。

       降低吸收部位和吸收途径肽酶的活性

       加入抑胰肽酶、杆菌肽、大豆酪氨酸抑制剂、硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸；分子结构修饰防止降解；延长作用时间，如采用生物粘附技术。

       03  生物技术药物制剂质量评价的方法

       化学药品一般具有纯度很高，终产品中杂质可以分析、确定且制订限量，产品相对稳定的特点，因此可以通过对其最终产品的质量检测实现对化学药品的全面质量控制。大多数生物技术药物目前上不可能做到这些。

       蛋白多肽类药物的质量评价特点

       为了保证生物技术药物产品的安全、有效、可控，必须从原料（包括菌、毒种）、生产工艺、半成品到成品进行全程的质量控制。蛋白质、多肽类药物除对成品进行质量控制外，还应对中间半成品进行质量控制，并有相应的质量控制标准，生物技术药物一般不以原料药的形式批准上市；但例外的类别是胰岛素，因其可形成晶态，在一定条件下可稳定保存。当然，随着液相及固相蛋白合成技术的进步与成熟，目前肽类药物的质量标准将在既往的基础上又明显提高。

       生物技术药物的质量控制

       传统的生物技术药物大多由活生物体（细菌或细胞）制备，具有复杂的分子结构，其生产涉及诸多生物学过程，如发酵、细胞培养、目的产物的分离纯化等，在这些生产过程中，目标产品容易受到各种生物或理化条件等的影响，因此质量控制标准与检测方法在生物技术药物研发中占有举足轻重的位置。上游工作构建、筛选得到的候选目标产品需要在建立检测控制方法和质控标准后逐步确定中试工艺，而完成**评价、药动学、药效学研究等临床前评价研究则需要工艺稳定、符合质控标准的供试样品，才能得到相对客观、重现性好的评价数据；同时中试工艺等下游工作和临床前评价研究所反映出的供试样品问题，可以促进检测控制方法和质控标准的完善与提高，以进一步优化制备工艺，并积极推动申请临床研究的进程。

       生物技术药物质量控制主要包括理化特性分析、生物学活性测定、残留杂质检测和制剂相关的安全性及常规检定等几个方面。这里以基因工程蛋白质类生物技术药物的质量控制为例加以介绍。

       理化性质鉴定

       理化性质鉴定包括特异性、分子量、等电点、肽图、吸收光谱、氨基酸序列等。特异性鉴定是利用蛋白的抗原性，根据抗原抗体特异反应对特定产品进行鉴别，包括免疫印迹、免疫电泳、点免疫、免疫扩散等方法。蛋白质分子量常采用质谱法和还原型SDS-PAGE电泳法测定。等电点一般采用等电聚焦电泳或毛细管电泳法测定，并与标准品或理论值比较。重组蛋白质的等电点往往是不均一的，但重要的是在生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，以反映其生产工艺的稳定性。等电点呈现多区带往往是产品结构不均一的表现，如二硫键配对错误、构型改变、C端降解等。肽图分析是指通过化学裂解法及蛋白酶裂解等各种手段，将蛋白断裂成大小不均的多个肽段，通过SDS-PAGE电泳、反相HPLC、毛细管电泳、质谱分析等各种手段分离检测，对空间构象较复杂，或因裂解不完全、二硫键仍然将各个片段连接在一起的特殊产品，则先用还原剂打开二硫键、封闭巯基后再按照常规方法进行分析。通过与天然产品或参考品的蛋白质一级结构作精密比较，肽图分析可确证表达产物结构的正确性以及批件产品结构的吸收波特征，符合280nm左右紫外特征吸收峰。N末端氨基酸序列分析是重组蛋白质和肽的重要鉴别标准，一般要求至少测15个氨基酸。有的蛋白质以单链和从中间断裂后形成链形式存在，这种情况就会测出两个不同的N末端，所以在质量标准中根据理论值可分别设定N末端为标准。N末端测序的基本原理为Edman化学降解法，目前已用蛋白质全自动测序仪进行N-端氨基酸序列测定，灵敏度已达到pmol水平。

       生物活性、比活性测定

       生物学活性测定是重组蛋白质类药物重要的质控指标，包括体外测定法、体内测定法、酶促反应测定法和免疫学活性方法等。体外测定法是指重组蛋白质类药物对培养细胞和离体动物器官生物学功能的影响；体内测定法是利用动物体内某些指标的变化确定产品的生物学活性单位；生化酶促反应测定法主要分析产品与底物或某种物质结合后发生的物理化学反应，如重组链激酶溶栓活性测定，即利用其于纤溶酶原结合后可激活纤溶酶，从而在纤维蛋白琼脂平板中形成溶圈；免疫学活性测定法采取酶联免疫吸附法（ELISA）等方法测定产品活性。蛋白质的生物学活性与其免疫学活性不一定相平行，只有蛋白肽键的抗原决定簇和生物活性中心相一致，ELISA法测定结果才能反映生物学活性。

       比活性是每毫克蛋白质的生物学活性单位，是进行成品分装的重要依据。蛋白质的空间结构不能常规测定，蛋白质空间结构的改变特别是二硫键的错误配对可影响蛋白质的生物学活性，从而影响蛋白质类药物的药效，比活性可间接地反映这一情况。通过对原料药比活性的检测，不仅可反映产品生产工艺的稳定性，而且还可以比较不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质控情况。一般比活性的标准可根据中试工艺优化后的多次检定结果统计后定出。

       纯度分析

       重组蛋白纯度分析一般采用HPLC和SDS-PAGE方法。进行SDS-PAGE分析时，结果应显示单一条带，纯度一般应大于95%。HPLC法应根据不同的纯化工艺选择不同的方法，一般尽量采用与SDS-PAGE法原理不同的反相柱或其他离子交换柱进行分析。进行HPLC分析时结果应呈单一峰，经积分计算产品纯度一般大于95%。如出现主峰以外的其他相关物质峰，则应对杂峰的性质进行分析。必要时，还需要采用适宜的方法测定相关蛋白（如异构体或缺失体）的含量，并制定对应的限量标准。

       含量测定

       蛋白质含量测定是生物技术药物质量控制的重要指标之一，其准确性对产品规格、分装量具有指导意义，是比活性计算、残留杂质的限量控制以及其他理化特性测定的基础，也是临床前安全和有效性评价研究中有效剂量、**剂量设置以及临床方案制订的重要依据。测定方法包括凯氏定氮法、Lowry法、BCA法、染色法、紫外吸收法、ELISA法和HPLC法等。其中Lowry法是经常使用的方法。

       二硫键分析

       二硫键形成是一种常见的蛋白质翻译后修饰，对稳定蛋白质的空间结构，保持及调节其生物活性有非常重要的作用。因此，确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白质化学结构的重要方面。

       目前常用的定位二硫键的方法分为非片断法和片断法。非片断法包括X射线衍射晶体结构分析法、多维核磁共振波谱法和合成对照法等。片断法包括对角线法、二硫键异构及突变分析法、酶解法和化学裂解法、部分还原测序法以及氰化半胱氨酸裂解法等。这些方法各具特点，也有各自的局限性。随着质谱仪器在质量检测范围、分辨率、灵敏度、准确度和分析速度等方面的不断发展，使质谱法更加适合二硫键的分析。二硫键的定位现多采用生化、质谱及测序等多种方法相结合来进行。

       残余杂质检查

       残余杂质可能具有**，也影响产品的生物学活性或使产品变质，可反映产品生产工艺的稳定性。残余杂质可分为外来污染物和产品相关的杂质两大类，外来污染物包括微生物污染、热源、细胞成分（例如细胞蛋白质、DNA等）、培养基中的成分、来自生产过程的物质；残留杂质限度设定是控制质量的重要手段。

       制剂相关的安全性及常规检定

       重组蛋白质药物制剂相关的安全性及常规检定一般包括外观、装量、pH、水分、无菌实验、异常**等。冻干是保证产品有效期内稳定性的重要工艺。水分检测主要针对冻干制剂，目前水分国际公认标准为不超过3.0%，所采用的方法有化学法（Fischer法）和称量减重法。近年来也有一些基因工程药物采用水针剂性，需要提供稳定性试验的资料，以证明在有效期内生物学活性不会明显降低；如果添加了其他化学稳定剂，也要提供安全性的资料。装量实验、pH检测和无菌实验对冻干制剂、水针剂性都是必要的。注射用制品无菌实验有增菌培养法和滤膜法，口服或外用制剂菌检项目有需氧菌、厌氧菌、真菌和支原体。异常**试验是主要检查生产工艺中是否含有目标产品意外的有毒物质。上市外观、装量、pH、水分、无菌实验、异常**等检测方法按《中国药典》规定的标准进行。

       小结

       以上不难看出，生物技术药物与化学药物相比较，药学研究方面存在很多不同之处，其所关注的质量控制的项目和关键点，对于化学药开发人员来说，概念还是比较模糊的。且当前所公开公布的生物药药学研究资料相对较少，远不如化学药药学研究资料之多。但生物技术药物的发展已经与化学药并列前行，理解生物药药学研究可以更好使我们理解药物。笔者也是本着学习的态度，在接下来的文章中，将继续介绍生物技术药物的临床前药理毒理评价，及药动学信息，以期与大家共同进步。

       参考：

       1. 《药品注册管理办法》

       2. 《新药研究与评价概论》.李晓辉，杜冠华。

       3. 《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则-试行》

       4. 《生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）》2015

       5. 生物类似药研发相关问题问与答. CDE官网