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点评 | 蒋华良（中国科学院院士院士，中科院上海药物研究所）、徐华强（中科院上海药物研究所）、刘志杰（上海科技大学）

责编 | 兮

C型G蛋白偶联受体（GPCR）是GPCR的一个亚家族，其成员主要包括钙敏感受体CaSR、代谢型谷氨酸受体mGluR、代谢型γ-氨基丁酸受体GABA_B和味觉受体等。不同于其他亚家族GPCR主要通过单体就能产生生理功能，C型GPCR是明确通过受体形成同源或异源二聚体形式而发挥生理作用。它们保守的捕蝇草结构域（VFT）能结合L氨基酸或者其衍生物，从而使受体发生构象变化，形成紧密的二聚体激活态构象。随着冷冻电镜技术方法的飞速发展，C型GPCR的结构研究取得了重要进展，其中mGluR5 （Nature 2019）和GABA_B (Nature 2020, Cell Research 2020)的全长结构最近相继得到解析。

钙敏感受体CaSR作为C型GPCR的成员，主要分布在人体的甲状腺、甲状旁腺、骨骼、肠道系统以及等器官中，能感应钙离子的浓度，通过调节钙离子的吸收和外排而维持人体中的钙离子平衡。CaSR 的失活性突变会引起高血 钙 疾 病, 如1 型家族性低尿钙性高钙血症（FHH1）、 新 生 儿 严 重 甲 状 旁 腺 亢 进 症 (NSHPT) 和成年人原发性甲状旁腺功能亢进症 (PHPT) 等；CaSR的激活性突变还能引起低血钙疾病,如 ADH1 和V 型巴特综合征等。

CaSR除了能够感受钙离子外，它还能够感受多种内源的氨基酸，氨基酸衍生物、多肽以及多胺化合物等。有关CaSR的生理、病理、细胞和生化研究已经开展很多年了，但是由于CaSR的全长三维结构没有得到解析，这些分子在结合到CaSR蛋白后，是起着激动剂（agonist）的作用还是扮演着正向变构调节剂（PAM）的作用，目前仍然不是很清楚。特别是配体结合CaSR胞外结构域之后如何将构象变化传递到跨膜结构域，以及全长CaSR蛋白的激活机制仍然不是很清楚，这些都极大限制了针对CaSR受体的相关药物研发。

2021年2月18日，中国科学技术大学田长麟团队与清华大学刘磊团队联合在Cell Research以长文（Article）形式在线发表了题为Structural mechanism of cooperative activation of the human calcium-sensing receptor by Ca²⁺ ions and L-tryptophan 的论文。该研究在国际上首次报道了人源全长钙敏感受体CaSR蛋白在四种不同条件下的冷冻电镜三维结构：不添加任何激动剂的“apo”-CaSR的inactive状态电镜结构；同时结合 L-Trp和 Ca²⁺两种配体的激活 (active) 状态的CaSR结构；单独结合L-Trp的CaSR结构；单独结合Ca²⁺的CaSR结构。通过结构分析首次阐明了CaSR的激活机制 (图1)：L-Trp紧密结合在CaSR的VFT配体结合口袋中，诱导VFT从开放状态变成关闭状态；高浓度钙离子结合到受体上，促使CaSR胞外的VFT结构域围绕二体对称轴发生扭转；该扭转通过刚性的CRD结构域传递到TMD，使TMD单体互相靠近形成TMD二聚体；CaSR形成激活态构象，为下游的G蛋白结合以及信号传递提供基础。

钙敏感受体CaSR在L-Trp和Ca²⁺两种激动剂的共同作用下的激活机制

激活状态CaSR的电镜结构(3.5 Å)显示受体同时结合了L-Trp和钙离子两种配体（图2b），此外，VFT结构域还发现有六个氨基酸位点发生了翻译后的糖基化修饰。激活状态的CaSR整体结构比较紧凑，二体界面从胞外的VFT结构域和CDR结构域一直延伸到跨膜结构域（TMD）。CaSR激活态的结构显示TMD以紧密的二聚体形式存在，其二体作用界面由跨膜螺旋TM6介导（图2a）。该激活态TMD的结构特征与mGlu5和GABA_B一致，在C家族GPCR中具有保守性。此外，ECL2与CRD相互作用，提高了CRD与TMD之间连接的刚性，在受体激活过程中发挥重要作用。

（a）激活态CaSR的电镜密度图以及整体结构。（b）结合在CaSR胞外结构域的L-Trp和Ca²⁺两种激动剂的电镜密度以及配位氨基酸信息。L-Trp显示为黄色棒状结构，Ca²⁺显示为洋红色球。

作者通过EDTA螯合二价金属离子，并且在不添加其他激活剂的条件下制备了“apo”-CasR样品。冷冻电镜结构显示“apo”-CaSR存在结构异质性，其胞外VFT结构域有三种不同构象：关关（inactive-close-close，Icc），开开（inactive-open-open, Ioo）和开关（inactive-open-close, Ioc）。其中Icc构象的VFT配体结合口袋中意外发现有一团电镜密度，该密度是CaSR受体在表达过程中结合的天然本底氨基酸或者氨基酸衍生物。（图3a）。文章作者进一步解析了只添加L-Trp的CaSR结构，该结构证实了以L-Trp为代表的的氨基酸是CaSR的激动剂，其功能是激动剂结合在VFT结构域的配体结合口袋中，从而诱导VFT从开放状态变成关闭状态（图3b）。

（a）“apo”-CaSR的VFT结构域具有“开开”、“开关”和“关关”三种不同的构象，其中关闭构象（CaSR-Icc）的VFT中结合了本底氨基酸或氨基酸衍生物。（b）CaSR结合单独的L-Trp配体，其结构呈现Icc构象。L-Trp结合在VFT的配体结合口袋中

为了研究单独钙离子对CaSR的激活作用，作者制备了单独添加高浓度钙离子的CaSR蛋样品。电镜结构解析结果非常令人意外，作者发现只添加钙离子的CaSR蛋白也存在结构异质性（图4a），有三种不同的构象：active（标注为CaSR- Ca²⁺）构象；Ioo（inactive-open-open）构象；Ioc（inactive-open-close）构象。这说明单独的高浓度钙离子并不能完全激活所有CaSR受体。而且值得注意的是，在激活状态的CaSR结构中，VFT配体结合口袋中同样有一团电镜密度，其位置与CaSR-Trp结构中的L-Trp的电镜密度一致 (图4b)。这说明单独加钙离子产生的激活态构象CaSRca不仅结合了钙离子，而且还结合了本底氨基酸或者氨基酸衍生物。进一步的功能实验表明，对参与L-Trp配位的氨基酸进行突变会使CaSR受体基本丧失功能活性，这从侧面验证了L-Trp是CaSR的激活剂，其对CaSR蛋白的激活必不可少 (图4c)。因此，作者提出一个观点：CaSR受体的激活需要L-Trp（或者其他氨基酸及氨基酸衍生物）和钙离子的共同协作。

（a）单独结合钙离子的CaSR具有构象异质性，分别为active构象（CaSR-Ca²⁺）、Ioo构象和Ioc构象。(b) CaSR-Ca²⁺结构的VFT配体结合口袋中结合了本底的氨基酸或者氨基酸衍生物。（c）细胞功能试验显示L-Trp对CaSR的激活必不可少。

CaSR是重要的药物靶标，目前靶向CaSR的药物有三种：小分子药物Evocalcet和Cinacalcet，多肽药物Etelcalcetide。这三种药物都是钙拟剂，是CaSR的变构激活剂，然而他们对CaSR的变构调节机制目前还不是很清楚。本研究中，作者首次展示了全长CaSR蛋白的高分辨三维结构，特别是之前从未报道过的TMD结构。该结构信息使得后续针对CaSR-TMD的别构调节药物设计和开发变得更加高效和准确。

本研究工作由中国科学技术大学的田长麟团队和清华大学的刘磊团队通力合作共同完成。中国科学技术大学生命科学学院的副研究员凌盛龙、石攀、刘三玲和博士研究生孟宪禹为论文的共同第一作者，中国科学技术大学的田长麟教授、孙德猛副研究员和清华大学的刘磊教授为本文的共同通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41422-021-00474-0

专家点评

蒋华良（研究员，院士，中科院上海药物研究所）

中国科学技术大学田长麟团队和清华大学刘磊团队两个课题组合作，综合应用冷冻电镜和GPCR功能实验，解析了在不同配体结合条件下的人源Ca²⁺敏感受体CaSR的三维结构。首次揭示CaSR在L-Trp和钙离子两种激活剂的共同协作的激活机制。

田长麟等这项工作做了较长时间，工作量特别大。我一直关注他们的这项研究，特别提醒他们关注非氨基酸电镜密度，从中可能发现蛋白质的化学修饰。在CaSR的冷冻电镜结构解析过程中，研究人员仔细分析了电镜密度数据，观察到了CaSR的胞外结构域有多个多余的非氨基酸电镜密度，结合这些氨基酸位点的确认，能初步推测是糖基化修饰。进一步应用糖基化修饰对接这些多余的电镜密度，确认了这些位点的糖基化类型。前期相关功能研究结果表明，突变其中多个糖基化位点的氨基酸会严重影响CaSR的上膜和药理学功能，说明这些位点的糖基化修饰对CaSR受体功能的重要性，值得进一步深入研究。

这项工作再一次表明，冷冻电镜技术的发展，除了能揭示蛋白质或蛋白质复合物的精细三维结构之外，还由于冷冻电镜方法对样品的要求并不严苛（如不需要结晶过程），能获得这些蛋白质的化学修饰位点和修饰类型，在三维结构水平上揭示这些化学修饰对蛋白质结构的影响，为进一步的功能研究提供重要线索（详见BioArt报道：学者笔谈丨蒋华良：冷冻电镜结构测定发现G蛋白偶联受体信号传导的新化学修饰）。

专家点评

徐华强（研究员，中科院上海药物研究所）

G蛋白偶联受体（GPCR）是细胞信号转导的重要膜受体蛋白，广泛参与人体中的各种生理以及病理过程，是新药开发的关键靶点蛋白，目前将近有30%的上市药物都是靶向GPCR发挥药效。哺乳动物GPCR可以分为五个亚家族，分别是视紫红质样受体（Rhodopsin）、分泌素样受体（Secretin）、粘附蛋白受体（Adhesion）、代谢型谷氨酸样受体（Glutamate）以及卷曲/味觉家族受体（Frizzled/taste2）。

代谢型谷氨酸样受体亚家族又称C型GPCR，该家族成员主要包括钙敏感受体CaSR、代谢型谷氨酸受体mGluR、代谢型γ-氨基丁酸受体GABA_B和味觉受体等。不同于其他亚家族GPCR通过单体就能产生生理功能，C型GPCR明确通过受体的二聚体发挥生理作用。截止目前，C型GPCR的成员中已经有三个蛋白的结构被解析，除了本研究报道的CasR外，mGluR5 （Nature 2019）和GABA_B (Nature 2020, Cell Research 2020) 的冷冻电镜结构已于近期相继被解析。

田长麟团队与刘磊团队合作研究通过解析四种不同条件下的CaSR蛋白结构，揭示了全长CaSR在激活过程中的完整构象变化过程，并且首次阐明了L-Trp和Ca²⁺两种配体在激活CaSR受体中的功能作用，从结构上完善了钙敏感受体CaSR的激活机制。通过比较分析可以发现这三个受体（mGluR5, GABA_B, CaSR）的非活性状态和活性状态的TMD结构域在构象上具有一定共性：在非活性状态的结构中，受体的两个TMD单体互相分隔较远，没有直接的相互作用界面，其最近的两个跨膜螺旋都是TM5。而当受体结合激动剂被激活后，两个TMD单体通过旋转互相靠近，形成紧凑的TMD二聚体，它们的二体相互作用界面都是TM6-TM6。这些共性表明C型GPCR在激活的过程中，其TMD的构象重排具有一定的保守性。

除了构象变化的共性外，CaSR蛋白在激活过程中具有不同于其他C型GPCR受体的独特性。mGluR5和GABA_B的VFT结构域结合激动剂后就能完全激活受体，形成TMD二聚体。然而本研究发现CaSR受体的VFT结合L-Trp激动剂后只能诱导VFT由开放状态变成关闭状态，形成一种中间激活态构象。而CaSR二体的扭转，以及TMD靠近形成完全激活态构象，则需要第二种激动剂Ca²⁺的结合。因此CaSR的完全激活需要L-Trp和Ca²⁺两种激动剂共同协作完成。

虽然最近对C型GPCR受体的三维结构以及功能机制研究取得了一定进展，目前仍然没有高分辨的C型GPCR与G蛋白的复合物结构被解析。目前所解析的A型与B型GPCR-G蛋白复合物全都是受体单体结构，那么G蛋白是如何结合到激活态的C型GPCR的二体TMD上的？一个C型GPCR受体是结合一个还是两个G蛋白？受体与G蛋白的结合机制是否与典型的A家族GPCR相同？此外，正向或者负向变构调节剂是如何调控C型GPCR受体的？这些问题都将是C型GPCR蛋白领域的研究前沿和热点。

专家点评

刘志杰（教授，上海科技大学）

中国科学技术大学田长麟团队和清华大学刘磊团队两个课题组合作，应用冷冻电镜技术在国际上首次解析了全长人源Ca²⁺敏感受体CaSR蛋白在四种不同条件下的三维结构。通过结构分析，首次阐明了L-Trp和Ca²⁺两种激动剂协同激活CaSR受体的结构基础。

该研究中有一个值得注意的发现，即 “apo”-CaSR的冷冻电镜结构存在构象异质性，其胞外VFT结构域有三种不同构象：关关（inactive-close-close，Icc），开开（inactive-open-open,Ioo）和开关（inactive-open-close, Ioc）。其中Icc构象的VFT配体结合口袋中有一团电镜密度，可能是CaSR表达过程中结合的天然本底氨基酸或者氨基酸衍生物，其对受体的结合力比较高，纯化过程中很难去除。进一步的CaSR-Trp结构解析证实以L-Trp为代表的的氨基酸是CaSR的激动剂，其功能是诱导VFT结构域中的配体结合口袋关闭。该研究发现CaSR受体可以高亲和力结合本底氨基酸或类似物配体，且不易被去除。这一现象非常值得关注，特别是设计针对CaSR的配体功能实验时，必须考虑到本底氨基酸类配体的影响。

研究人员针对CaSR蛋白还观察到了一个特殊现象：CaSR受体需要L-Trp（或者其他氨基酸及氨基酸衍生物）和Ca²⁺协同作用才能激活CaSR。研究人员解析了单独Ca²⁺结合的CaSR结构，结果发现其构象也存在异质性，有三种构象：激活态（CaSR-ca），Ioo（inactive-open-open）和Ioc（inactive-open-close）构象。而且激活态CaSR除了结合钙离子外，其VFT配体结合口袋中还发现了本底氨基酸配体的电镜密度。这说明单独加Ca²⁺并不能完全激活CaSR受体，其激活仍然需要氨基酸类配体的协同作用。长期以来,CaSR的功能研究认为高浓度Ca²⁺能够单独激活CaSR，这很可能是因为无意中忽视了本底氨基酸配体的存在，特别是这些氨基酸配体在细胞功能试验的清洗过程中很难被完全去除。