2025年12月，EMA正式发布合成多肽开发与制造指南，并确定于2026年6月1日生效。这份指南的形成经历了完整的欧盟监管咨询程序：2023年9月，Quality Working Party形成指南草案；同年10月，CHMP和CVMP分别同意将草案发布征求意见；公开咨询自2023年10月18日开始，至2024年4月30日结束；经过意见整理和文本修订后，Quality Working Party于2025年11月21日达成最终一致，随后CHMP于2025年12月1日采纳，CVMP于2025年12月4日采纳。
这个过程显示，合成多肽已被EMA作为一类具有独立质量风险特征的治疗分子进行系统规范。指南的定位也十分明确：在既有化学原料药指南基础上，补充合成多肽（非生物方法的多肽制备）在制造工艺、起始物料界定、杂质控制、结构表征、规格设定、分析方法、偶联修饰、制剂开发和临床阶段资料中的特定要求。
1.起始物料
起始物料界定是受影响最直接的部分。EMA指南认可受保护天然L-氨基酸衍生物通常可作为合成多肽起始物料，也认可部分短肽片段在充分论证时可作为起始物料，例如用于减少DKP形成风险的二肽，或用于降低肽链组装聚集倾向的Dmb-Gly和伪脯氨酸二肽。
需要注意的是，这些可以认定为regulatory starting material的多肽实际上都属于二肽范畴。更长的多肽并不默认许可为多肽的GMP生产原料，申请者如果需要使用更长的多肽作为GMP原料，需要提前与监管机构进行沟通。片段越长、越接近最终API、越携带关键构型或修饰结构，作为起始物料的论证难度越高。对于长片段缩合项目，若希望将某一片段定义为起始物料，资料中应说明该片段的合成路线、关键质量属性、杂质谱、立体化学控制、残留保护基和后续GMP步骤充分性，并证明该片段杂质不会在最终API中形成难以清除或难以检测的结构相关杂质。但通常来说，长肽被批准作为多肽GMP生产的regulatory starting material的可能性不大，这些长肽仍然需要在GMP的条件下进行生产。
2.PEG-NHS和复杂linker
复杂偶联多肽是该指南专门论述的一个领域，这也体现了多肽药物在模态设计上越来越复杂精细的行业现状。
PEG化、脂肪酸修饰、多肽-linker-载荷以及用于影像或靶向递送的偶联结构，都会引入非肽结构单元。EMA要求说明偶联化学的工艺，并通过风险分析区分可偶联杂质和不可偶联杂质。可偶联杂质能够进入目标分子，形成与API结构相近的偶联相关杂质；不可偶联杂质则可能以游离形式残留，或影响反应效率、纯化行为和稳定性。例如PEG化多肽，游离未偶联肽/游离PEG/linker、二PEG化、多PEG化和非位点特异性PEG化产物均应成为控制对象。
该指南专门以PEG-NHS作为范例。EMA指南明确指出，合适PEG起始物料的活化步骤属于制造工艺的一部分，NHS酯形式的活化PEG可能不适合作为起始物料，而应该被视为中间体。按照这一逻辑，未活化PEG可以作为待论证的起始物料；将PEG转化为PEG-NHS的活化反应、活化产物纯化、分装、储存、复验和放行，应纳入中间体制造和质量控制。若企业外购PEG-NHS，该供应商在注册资料中的角色会接近中间体制造商，而PEG-NHS需要在GMP的条件下进行生产，要求明显高于普通化学品供应商。
3.制备纯化
多肽制备纯化通常从复杂粗肽开始，目标峰与前洗脱、后洗脱结构相关杂质之间难以完全分离。行业中常见做法是收集高纯度主馏分，将较低纯度边馏分进行再纯化后与主馏分合并，以兼顾质量和收率。EMA指南认可这一操作，但要求再纯化作为常规工艺进行预定义、说明和论证。常规的再纯化若属于制造工艺组成部分，将不作为reprocessing处理；重复偶联若属于常规工艺，也不作为reprocessing处理。前提是这些操作被明确写入工艺，并纳入工艺确认或验证。
实际开发中，制备纯化不能只记录最终合并池纯度。工艺开发应建立主池（main pool）、边池（side pool）和废弃池（discarded pool）的判定标准。主池标准可包括目标峰纯度、单个指定杂质限度、单个未知杂质限度、总杂限度、HMW（高分子量杂质）杂质限度、必要时的MS确认。边池标准应说明哪些允许再纯化，例如目标峰含量下限、特定难清除杂质上限、不得含有超过某水平的毒理关注杂质或HMW杂质。废弃池标准也应明确，例如目标峰比例过低、关键杂质过高、峰形异常、存在不可接受的HMW杂质或与其他产品交叉污染风险。
再纯化条件也需要固定。企业应规定可重复纯化次数、色谱柱类型、流动相体系、梯度范围、装载量、收集窗口、再纯化后合并标准和偏差处理方式。若采用连续再纯化或自动循环进入主流程，需要说明系统控制逻辑和在线或离线检测方法。对于使用同一制备柱连续生产不同多肽的情形，还应建立防止交叉污染的清洁策略和柱使用管理。商业批工艺验证应覆盖正常主池操作以及代表性边池再纯化操作，不能只验证理想主峰收集条件。
这一变化对工艺开发的影响在于，收率提升策略需要在开发阶段完成工艺定义和验证。若申报文件中只写制备色谱纯化，实际生产中根据经验反复收集、再纯化和合并边馏分，现场检查和审评时都可能被认为工艺不清晰。若额外再纯化发生在预定义规则之外，则可能被归入reprocessing或偏差处理，需另行论证其对杂质谱和质量一致性的影响。
4.杂质谱研究
合成多肽的杂质谱具有序列相关性。EMA指南将多肽相关杂质来源分为起始物料、制造过程和储存降解。起始物料可带入错误构型、错误氨基酸、β-丙氨酸残基、二肽杂质、单个氨基酸衍生物杂质和错误保护形式。制造过程可产生非对映异构体、缺失序列、截短序列、插入序列、裂解副产物、未完全脱保护产物和反应性阳离子捕获产物。储存或工艺过程中的降解可涉及氧化、水解、异构化、脱酰胺、天冬酰亚胺形成、二酮哌嗪、焦谷氨酸、β-消除、脱氢肽形成、二硫键断裂或交换以及乙酰化。HMW杂质还可能包括二聚体、寡聚体、聚集体或支化产物。
EMA采用欧洲药典关于多肽相关杂质的阈值，即0.1%以上报告（reporting threshold）、0.5%以上鉴定（identification threshold）、1.0%以上确证（qualification threshold）。最终API的纯度方法至少需要证明在0.1%水平具备报告能力。多肽杂质阈值的指南，历来都是一个比较模糊的领域，缺乏像小分子API那样统一明确的指南，例如ICH Q3就说明不涵盖合成多肽。EMA此次重申的体系，仍然来自与欧洲药典。需要指出的是，在实际操作中，很多制药公司采取的是更严格的杂质阈值标准，例如0.1%的报告阈值，0.3%的鉴定阈值和0.5%的qualification阈值。
若一个RP-HPLC方法无法分离所有多肽相关杂质，应增加正交方法，例如不同pH或不同选择性的RP-HPLC、离子交换色谱、SEC、LC-MS、肽图、手性方法或针对特定非对映异构体的专属性方法。共洗脱峰不能简单按单一杂质处理。若无法证明峰内只有一个杂质，限度和确证逻辑应按组合峰考虑，毒理批或临床批中的杂质谱也需要用于支持该组合峰的安全性评价。
方法开发的时间点也需要前移。早期临床阶段可以保留一定灵活性，但从II/III期开始，主要杂质类别应有清楚认知。若后期方法优化导致新杂质被观察到，企业需要比较毒理批、临床批、工艺验证批和商业代表批数据，说明新杂质是否曾经存在、是否被临床暴露覆盖、是否影响既有安全性论证。该要求会改变多肽项目的开发节奏。把高分辨率杂质方法、LC-MS结构归属和正交方法留到申报前，会增加临床桥接和规格重设风险。
5.对照品
多肽对照品管理是指南中特别具体的部分。若采用一级对照品和工作对照品两级体系，需要说明两级对照品的制备、确认、表征、定期再确认、未来批次确认以及防止多肽含量漂移（peptide content drift）的措施。多肽常为吸湿性粉末，且常以醋酸盐、三氟醋酸盐、盐酸盐或其他counter-ion形式存在。水分、残留溶剂、无机残留、counter-ion和相关杂质都会影响含量值。若对照品assay不清楚，将导致API assay、制剂配料、标签量和稳定性趋势都可能出现偏差。
实际操作中，一级对照品应优先来自充分表征的代表性API批次或专门制备批次。表征项目应包括身份确认、分子量、序列、纯度、相关杂质、HMW杂质、水分、残留溶剂、无机残留、counter-ion种类和含量，必要时包括氨基酸分析、qNMR、元素分析或手性分析。含量赋值可采用质量平衡法，也可结合qNMR或氨基酸分析等方法。质量平衡计算应明确扣除水分、残留溶剂、无机残留、counter-ion和相关杂质后的基准，避免把含盐含水质量直接等同于peptide base含量。
工作对照品应通过一级对照品桥接获取assay。桥接研究不应只做一次HPLC面积归一化比较，而应包括含量测定、纯度、主要杂质、色谱行为、必要时的水分和counter-ion对比。工作对照品应有复验期、开瓶使用期、储存条件和使用记录。对于吸湿性强的多肽，使用前检测水分更稳妥；对于称量误差和吸湿影响难以控制的场景，可考虑溶液型对照品，但需要论证溶液稳定性和运输储存条件。
6.注射用多肽制剂：终端灭菌可行性需要进入早期开发
多肽制剂大多为注射给药。EMA指南延续欧盟对灭菌工艺的基本立场，终端灭菌具有最高无菌保证水平，应作为优先选择。灭菌工艺选择应在制剂开发早期完成系统评估。
终端灭菌仍是优先考虑的灭菌方式；采用无菌过滤、预灭菌容器密封系统及无菌灌装工艺时，应以产品特异性研究数据支持终端灭菌不适用于该制剂。相关研究应覆盖满足SAL ≤ 10??要求的低应激终端灭菌条件下的含量变化、降解杂质、高分子量杂质或聚集体形成、关键理化属性变化，并在相关情况下评价生物活性和免疫原性风险。终端灭菌导致的杂质升高，应结合杂质鉴定、确证情况、处方和包装优化结果以及非临床或临床批次覆盖情况进行综合判断；经优化后仍出现不可接受的质量变化时，方可支持采用无菌过滤和无菌灌装路线。
若终端灭菌不可行，申报资料需要提供实验证据，而非单纯说明多肽热敏。企业应证明在最低应力终端灭菌条件下，产品发生不可接受的质量变化，并说明制剂工艺优化、缓冲体系、容器选择和工艺条件已经充分考察。若热处理产生的降解物在毒理或关键临床批中已有覆盖，可用于支持相关杂质安全性；若未覆盖，可能需要补充安全性或免疫原性风险评估。对于存在聚集倾向的多肽，热应力下高分子量杂质和聚集体性质也应纳入处方开发和稳定性研究，并在必要时进入成品放行和稳定性规格。
这一要求使无菌工艺路径决策前移。多肽项目不能在商业申报阶段才决定采用无菌过滤和无菌灌装。若早期开发未开展终端灭菌可行性研究，后期可能面临补充研究、临床批桥接或处方调整。对于欧盟市场申报，制剂团队需要在临床早期就与API杂质方法开发协同，确保热降解杂质能够被检测、鉴定和必要确证。
7.产业影响
EMA合成多肽指南对行业的影响具有选择性。常规线性SPPS多肽的基本工艺不会发生根本变化，但申报资料的详细程度、起始物料控制、杂质方法和对照品策略会受到影响。复杂修饰多肽受到的影响更大，包括PEG化多肽、脂肪酸修饰多肽、片段缩合多肽、多肽-linker结构、含非天然氨基酸或复杂环化结构的多肽，以及合成版本参比生物来源多肽。这些项目的质量风险集中在上游物料、偶联组分、结构异质性、共流出杂质、HMW杂质和制剂稳定性，正好对应指南中最 具体的要求。
对CDMO和API企业而言，竞争能力将从序列合成、纯化收率和交付速度扩展到完整CMC体系。未来高价值多肽项目需要企业具备以下能力：起始物料杂质传递评估，短肽片段和复杂中间体GMP制造，PEG/linker供应商注册资料管理，正交杂质方法和LC-MS结构归属，注射剂灭菌路径评价，以及欧盟CTD文件组织能力。
对上游供应商而言，保护氨基酸、预装载树脂、PEG、linker和特殊偶联组分的资料完整性将成为商业竞争因素。能够提供合成流程、关键杂质谱、批分析、稳定性、变更通知、GMP或适当质量体系支持的供应商，更容易进入商业化多肽供应链。无法提供活化PEG、复杂linker或聚合物分布控制资料的供应商，将增加客户申报风险。
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