近年来，核酸类药物因为设计简单、研发周期短、成功率高、特异性强、能够在根本上调控致病基因等优势，成为众多难治疾病治疗方案的研究热点。不过核酸类药物自身也存在一些问题，如体内稳定性差，容易被体内的核酸酶降解或被肾脏清除；核酸类药物本身分子量大且带有负电荷，难以跨越细胞膜到达胞内来发挥作用；核酸类药物在体内的靶向性弱，不能精准靶向目标细胞或组织，可能会在实际应用中产生脱靶效应，导致副作用从而损伤机体，进入细胞内的药物还会面临被溶酶体水解的风险，以及在循环过程中非特异性吸附蛋白而无法发挥作用等。因此，除通过化学修饰改善核酸稳定性和免疫原性外，还需为其提供高效安全的体内递送系统。当前核酸药物开发可分为化学改造和物理改性两大方向，二者可单独或共同提升核酸药物体内外稳定性和特定组织、细胞内的翻译效率。目前已开发出多种核酸改造和递送技术，主要包括化学修饰、配体偶联和纳米递送载体。

       化学修饰

       核酸化学修饰广泛用于ASO、siRNA、miRNA、mRNA等核酸类药物，有助于核酸类药物在疾病治疗中发挥作用。对核酸类药物进行修饰能够提高其抗酶解能力，保持序列的稳定性并延长半衰期，可以增加药物的脂溶性，降低免疫原性。同时，化学修饰可以提高靶向性，如在核酸序列的末端引入细胞表面特异性识别的配体或适配体，提高核酸类药物的沉默效率和催化反应效率等。

       1、磷酸基团修饰

       磷酸基团的修饰常在非桥连氧原子上进行，应用较为广泛的是硫原子取代磷酸基团的一个非桥连氧原子，从而形成硫代磷酸酯键。硫代磷酸酯键有利于提高核酸的抗酶解能力和与血浆蛋白的结合能力，从而延长其在体内的循环时间。然而，硫代修饰的不足之处在于其与靶序列的结合力较弱，且高含量的硫代磷酸酯键可能带来细胞毒性和免疫刺激等副作用。因此，硫代磷酸酯键的位置和数量对于递送效率也很重要。此外，磷酸基团上的氧原子还可被各种胺基、硼 烷基取代，或整个磷酸基被酰胺基、胺氧基、烷氧基、三氮唑基等取代，但这些应用均不如硫代修饰普遍。

       2、碱基修饰

       对碱基的修饰主要为碱基的取代基修饰或碱基的替换，嘧啶的5-位和嘌呤的8-位是常用的取代位点。常用的碱基修饰类型有假尿苷、2-硫尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷等。其中用假尿苷代替尿嘧啶是常见的碱基修饰之一。研究证明，替换成假尿苷可改善编码Cas9 的 mRNA 的翻译并降低其免疫原性。此外，N-乙基哌啶-6-三唑修饰的腺苷类似物可以阻碍siRNA 与Toll样受体8的相互作用，降低免疫原性。6'-苯基吡 咯胞嘧啶是一种胞嘧啶类似物，具有良好的碱基配对效应、热稳定性和强荧光性。siRNA 经 6'-苯基吡 咯胞嘧啶修饰后其基因沉默效果不受影响，且其荧光特性可用于检测细胞内 siRNA 的摄取和运输。

       3、核糖修饰

       核糖修饰主要有两种类型，一种是在其 2' 位引入不同大小和极性的基团，常见的有 2'-甲氧基、2'-甲氧基乙氧基和 2'-脱氧-2'-氟等；另一种是在 2' 位及其他核糖位点同时进行修饰，如锁核酸 (locked nucleic acid，LNA)、肽核酸 (peptide nucleic acid，PNA) 和磷酰二胺吗啉代寡核苷酸 (phosphoramidite morpholino oligonucleotides，PMO) 等。2'位修饰对于抑制核酸酶的水解很重要。2'-甲氧基修饰是目前应用较广泛的核糖修饰手段，可以增强药物与靶 mRNA 的结合性、抑制核酸酶的水解、减弱体内免疫原性，并赋予核酸结构一定的脂溶性。2'-甲氧基乙氧基是 2'-甲氧基的类似物，具有相似的性质，但对靶 mRNA 的亲和力和抗酶解能力更强。2'-脱氧-2'-氟修饰可以提高 siRNA 的亲和力和稳定性。在核糖的2'、4'位甚至整个糖环进行修饰也会产生较好的效果。

       锁核酸是一种核酸构象的限制性修饰，采用 C3'-内切构象，其可以仅用较短的序列来保持较高的靶亲和力和抗酶解能力。但短序列的锁核酸的脱靶效应和毒性问题较为严重，因此实际应用中常采用解锁核酸、限制性乙基桥核酸、三环 DNA、乙二醇核酸来替代，并且将这四种核糖修饰与硫代磷酸酯修饰组合运用可以获得更好的治疗效果。PMO和肽核酸修饰带来的电中性结构可以提高核酸类药物的稳定性和亲和力。PMO 的水溶性较好，应用较为广泛，目前一些 PMO 修饰的 siRNA 和miRNA 已进入临床试验阶段。PMO 还可以进一步修饰，如引入穿膜肽和带正电性的胺基，以提高其跨膜能力。

       偶联配体

       核酸药物可通过共价偶联脂质、半乳糖、蛋白/多肽或适配体等来延长体内循环时间，增加在特定组织和细胞的蓄积与摄取。利用特定的偶联配体不但能调节核酸药物与血浆蛋白的结合，改善药物的组织分布，还能通过配体靶向细胞表面受体实现特定组织或细胞的递送。同时，还可通过设计配体与核酸药物之间的连接键，如采用酸敏感的酰胺键、在胞质中易被还原断开的二硫键或 Dicer 敏感键等，使核酸药物在进入特定生理环境后与偶联物分离，有效适应特定的治疗机制。

       1、脂质偶联

       寡核苷酸共价结合脂质及其衍生物形成的缀合物可增强寡核苷酸的体内递送效率。如在3'末端共价键合胆固醇的siRNA可有效沉默肌肉生长抑素诱导肌肉生长，共价键合α-生育酚的siRNA可沉默小鼠肝脏中ApoB。偶联胆固醇的RNA可通过与高密度脂蛋白 (high-density lipopro‐tein，HDL)或低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL) 的预组装，可增加特定组织和细胞的摄取，改变siRNA 的分布。与游离siRNA-胆固醇相比，和HDL预组装的 siRNA-胆固醇(HDL siRNA) 可在肝脏和空肠中产生更强的沉默效应。进一步研究发现，与 LDL预组装的siRNA-胆固醇(LDL siRNA)颗粒几乎只在肝脏中吸收，而HDL siRNA 颗粒主要由肝脏、肾上腺、卵巢、肾脏和小肠吸收。因此，研究者提出 siRNA-胆固醇的内吞作用分别由HDL和LDL相关的B类I型清道夫受体和LDL受体介导。还有研究发现siRNA-脂质缀合物与不同类别脂蛋白的体内结合效力受其疏水性影响，疏水性更强的缀合物优先结合LDL，而疏水性弱的缀合物优先结合HDL。因此可以通过偶联不同疏水性的脂质实现 RNA 药物在不同组织的靶向递送。

       2、N-乙酰氨基半乳糖 (N-acetylgalactosamine，GalNAc) 偶联

       GalNAc是一种与去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR) 高度亲和的二糖类化合物。ASGPR在肝脏中高度特异性表达，采用GalNAc偶联的RNA药物有望实现肝脏的高效特异性递送。2019年，第1个靶向δ-氨基乙酰丙酸合酶1的GalNAc偶联siRNA药物Givosiran 获批用于治疗急性间歇性卟啉症患者。2020年底，两种GalNAc偶联siRNA 药物lumasiran 和inclisiran 也分别获批临床使用。Lumasiran 是一种用于治疗1型原发性高草酸尿症的siRNA 药物，可降低肝细胞中羟基酸氧化酶1的mRNA的翻译。Inclisiran是一种用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的 siRNA药物，可降低前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型的mRNA 的翻译。然而ASGPR只在高度分化的肝细胞中高表达，而在低度分化的肝癌细胞系中表达水平较低，GalNAc 偶联用于肝癌治疗的策略仍有待改进。此外，由于肝外组织缺乏ASGPR 的表达，尚无法通过GalNAc 偶联技术实现高效的 RNA 药物递送。

       3、多肽偶联

       细胞穿透肽 (cell penetrating peptide，CPP) 一般是由5～30个氨基酸组成的两亲性或阳离子肽片段，包括HIV-1 (human immunodeficiency virus-1)反式激活因子 (HIV-Tat)、果蝇的触角足同源异形域的DNA 结合结构域第 3 片段 (peneytatin 1)、由神经肽甘丙肽和乳突蛋白合成的嵌合肽 (transportan) 或基于碱性氨基酸 (如精氨酸和赖氨酸) 的聚合物等。CPP 与负电核酸或电中性的改造核酸偶联后，可增加偶联物整体的正电性，促进核酸的细胞摄取。当前已有多个多肽-PMO (peptide-PMO， PPMO) 缀合物处于临床前研究阶段。PPMO M23D-B能增强肌营养不良蛋白外显子 23 的跳跃，实现疾病模型小鼠肌肉中肌营养不良蛋白的持续表达，富含精氨酸的 Pip6a 肽与 PMO的缀合物 (Pip6a-PMO) 可直接携带核酸进入脊髓性肌萎缩模型动物的中枢神经系统，通过靶向CUG 重复扩增的转录本，增强运动神经元存活蛋白的表达，治疗I型强直性营养不良(myotonic dystrophy 1，DM1)。除CPP 外，靶向胰高血糖素样肽1受体 (glucagonlike peptide 1 receptor，GLP1R) 的GLP1 样肽和多价环状精甘天冬氨酸肽(cyclic arginylglycylaspartic acid，cRGD) 也已证明可介导RNA 递送。研究者将由40个氨基酸构成的GLP1样肽修饰于ASO羧基末端，可在胰岛β细胞中沉默靶基因。cRGD 修饰的siRNA可特异性递送至高表达αvβ3 整合素的黑色素瘤细胞，敲低靶基因。上述研究表明多肽偶联可改善 RNA 的组织分布和细胞摄取。不过，多肽与 RNA之间也可能因异种电荷而相互吸引而导致团聚，进而影响RNA 的递送效力。

       4、抗体/适配体偶联

       目前已有3种非结合型 PMO药物eteplirsen、golodirsen和viltolarsen 获批用于治疗杜氏肌营养不良症，然而，其改善肌肉的效果仍有待提高。研究者尝试通过受体介导的方法增强用于肌肉疾病的寡核苷酸药物递送，如偶联转铁蛋白受体 (trans‐ferrin receptor，TfR) 的抗体加强肌肉组织递送效率。TfR作为铁结合转铁蛋白的主要入口，在高代谢活性的骨骼肌细胞、心肌细胞、脑内皮细胞和增殖性肿瘤细胞中高表达，可在网格蛋白介导下将偶联物内化。通过此途径，TfR 能促使 siRNA-抗体/适配体偶联物进入肌肉或跨越血脑屏障进入中枢神经系统，沉默特定基因的表达。基于受体-配体的相互作用，已有多种受体被证实可提高 siRNA和ASO 的靶向递送效率，包括人类表皮生长因子受体2、T 细胞标记物 CD7、转铁蛋白受体 CD71、CD44、A 型肝配蛋白受体-2 和表皮生长因子受体等。

       核酸适配体是长度为20～100 nt的单链DNA或RNA， 能形成特定且稳定的三级结构，从而与靶分子高特异性稳定结合，因此也被称为"化学抗体"。相较于蛋白抗体，核酸适配体制造简单、成本低廉、尺寸小、免疫原性低。通过将核酸适配体与特定 RNA 药物偶联，可增强目标 RNA 的体内靶向递送。前列腺特异性抗原 (prostate specific membrane antigen，PSMA) 适配体A10是第一代靶向 PSMA 阳性细胞的核酸适配体。经A10偶联的siRNA可显著抑制PSMA阳性细胞内 PLK1 和 BCL2 基因的表达，实现核纤层蛋白A/C基因沉默。类似地，gp120的RNA 适配体可通过由2'-OMe 和2'氟嘧啶修饰的富含GC 序列的核酸短链结构连接 siRNA 形成复合物，抑制模型小鼠体内的 HIV-1复制。

未完待续！

       参考资料

       [1]李丹，黄宇坤，高小玲.RNA药物递送研究进展[J].药学学报，2023，58(03)

       [2]王峻峰，谭曼曼，王颖等.核酸类药物的修饰和递送研究进展[J].浙江大学学报(医学版)，2023，52(04)       

       作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。